Ein Konsortium von angesehenen Wissenschaftlern hat das im Januar 2020 veröffentlichte wissenschaftliche Papier „Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR” (Eurosurveillance 25(8) 2020)“ (im Bericht als „Corman-Drosten-Papier“ bezeichnet) von den Hauptautoren Victor M Corman und Christian Drosten analysiert und den Review Report am 27. November 2020 hier veröffentlicht.
Wir bieten Ihnen nachfolgend die deutsche Übersetzung des Berichts (ohne Gewähr auf etwaige Übersetzungsfehler).
Übersichtsbericht Corman-Drosten et al. Eurosurveillance 2020
27. November 2020
Dieser ausführliche Überprüfungsbericht wurde am 27. November 2020 offiziell über das Einreichungsportal an die Redaktion von Eurosurveillance übermittelt. Diesem Überprüfungsbericht ist ein von allen Haupt- und Mitautoren unterzeichnetes Widerrufsschreiben beigefügt. Der erste und der letzte aufgeführte Name sind der erste und der zweite Hauptautor. Alle Namen dazwischen sind Mitautoren.
Die externe Begutachtung des RT-PCR-Tests zum Nachweis von SARS-CoV-2 zeigt 10 wichtige wissenschaftliche Mängel auf molekularer und methodischer Ebene: Konsequenzen für falsch positive Ergebnisse.
Pieter Borger(1), Bobby Rajesh Malhotra(2) , Michael Yeadon(3) , Clare Craig(4), Kevin McKernan(5) , Klaus Steger(6) , Paul McSheehy(7) , Lidiya Angelova(8), Fabio Franchi(9), Thomas Binder(10), Henrik Ullrich(11) , Makoto Ohashi(12), Stefano Scoglio(13), Marjolein Doesburg-van Kleffens(14), Dorothea Gilbert(15), Rainer Klement(16), Ruth Schruefer(17), Berber W. Pieksma(18), Jan Bonte(19), Bruno H. Dalle Carbonare(20), Kevin P. Corbett(21), Ulrike Kämmerer(22)
Kurzfassung:
In der Veröffentlichung mit dem Titel „Nachweis des neuartigen Coronavirus 2019 (2019-nCoV) durch Echtzeit-RT-PCR“ (Eurosurveillance 25 (8) 2020) präsentieren die Autoren einen diagnostischen Workflow und ein RT-qPCR-Protokoll zum Nachweis und zur Diagnose von 2019-nCoV (jetzt als SARS-CoV-2 bekannt), von denen sie behaupten, dass sie validiert sind, sowie eine robuste Diagnosemethode für den Einsatz in Laborumgebungen im öffentlichen Gesundheitswesen.
In Anbetracht aller Konsequenzen, die sich aus dieser Veröffentlichung für Gesellschaften weltweit ergeben, führte eine Gruppe unabhängiger Forscher eine Punkt-für-Punkt-Überprüfung der oben genannten Veröffentlichung durch, in der
1) alle Komponenten des vorgestellten Testdesigns überprüft wurden,
2) die RT-qPCR-Protokollempfehlungen bezüglich guter Laborpraxis bewertet wurden und
3) Parameter, die anhand einschlägiger wissenschaftlicher Literatur auf diesem Gebiet untersucht wurden.
Das veröffentlichte RT-qPCR-Protokoll zur Erkennung und Diagnose von 2019-nCoV und das Manuskript weisen zahlreiche technische und wissenschaftliche Fehler auf, darunter ein unzureichendes Primerdesign, ein problematisches und unzureichendes RT-qPCR-Protokoll und das Fehlen einer genauen Testvalidierung. Weder der vorgestellte Test noch das Manuskript selbst erfüllen die Anforderungen für eine akzeptable wissenschaftliche Veröffentlichung. Darüber hinaus werden schwerwiegende Interessenkonflikte der Autoren nicht erwähnt. Schließlich bedeutet der sehr kurze Zeitraum zwischen Einreichung und Annahme der Veröffentlichung (24 Stunden), dass hier kein systematischer Peer-Review-Prozess durchgeführt wurde oder von problematischer schlechter Qualität ist. Wir liefern überzeugende Beweise für verschiedene wissenschaftliche Unzulänglichkeiten, Fehler und Mängel.
Angesichts der hier vorgestellten wissenschaftlichen und methodischen Mängel sind wir zuversichtlich, dass die Redaktion von Eurosurveillance keine andere Wahl hat, als die Veröffentlichung zurückzuziehen.
DETAILLIERTER ÜBERPRÜFUNGSBERICHT
Dieses Papier wird zahlreiche schwerwiegende Mängel im Corman-Drosten-Papier aufzeigen, deren Bedeutung zu einer weltweiten Fehldiagnose von Infektionen geführt hat, die SARS-CoV-2 zugeschrieben werden und mit der Krankheit COVID-19 assoziiert sind. Wir sind mit strengen Sperren konfrontiert, die das Leben und den Lebensunterhalt vieler Menschen zerstört haben, den eingeschränkten Zugang zu Bildung und diese von Regierungen auf der ganzen Welt auferlegten Einschränkungen, die einen direkten Angriff auf die Grundrechte der Menschen und ihre persönlichen Freiheiten darstellen und zu Kollateralschäden für ganze Volkswirtschaften führen globaler Maßstab.
Es gibt zehn schwerwiegende Probleme mit dem Corman-Drosten-Papier, die wir in den folgenden Abschnitten genauer skizzieren und erläutern werden.
Das erste und wichtigste Problem ist, dass das neuartige Coronavirus SARS-CoV-2 (in der Veröffentlichung mit dem Namen 2019-nCoV und im Februar 2020 mit dem Namen SARS-CoV-2 von einem internationalen Konsortium von Virusexperten) auf in silico (theoretischen) Sequenzen basiert, geliefert von einem Labor in China [1], da den Autoren zu diesem Zeitpunkt weder Kontrollmaterial für infektiöses („lebendes“) oder inaktiviertes SARS-CoV-2 noch isolierte genomische RNA des Virus zur Verfügung stand. Bisher wurde von der Autorenschaft keine Validierung basierend auf isolierten SARS-CoV-2-Viren oder deren RNA in voller Länge durchgeführt. Nach Corman et al.:
„Wir wollten robuste Diagnosemethoden für den Einsatz in Laborumgebungen des öffentlichen Gesundheitswesens entwickeln und einsetzen, ohne dass Virenmaterial verfügbar ist.“ [1]
Der Schwerpunkt sollte hier auf den beiden genannten Zielen liegen:
a) Entwicklung und
b) Einsatz eines Diagnosetests zur Verwendung in Laborumgebungen des öffentlichen Gesundheitswesens.
Diese Ziele sind nicht erreichbar, ohne dass tatsächlich Virusmaterial verfügbar ist (z. B. zur Bestimmung der infektiösen Viruslast). In jedem Fall kann nur ein Protokoll mit maximaler Genauigkeit das obligatorische und primäre Ziel in jedem Szenario-Ergebnis dieser Größenordnung sein. Die Bestimmung der kritischen Viruslast ist eine obligatorische Information, und es liegt in der Verantwortung der Gruppe von Christian Drosten, diese Experimente durchzuführen und die entscheidenden Daten bereitzustellen.
Trotzdem wurden diese in silico-Sequenzen verwendet, um eine RT-PCR-Testmethode zur Identifizierung des vorgenannten Virus zu entwickeln. Dieses Modell basierte auf der Annahme, dass das neuartige Virus SARS-CoV aus dem Jahr 2003 sehr ähnlich ist, da beide Beta-Coronaviren sind.
Der PCR-Test wurde daher unter Verwendung der Genomsequenz von SARS-CoV als Kontrollmaterial für die Sarbeco-Komponente entworfen; Wir wissen dies aus unserer persönlichen E-Mail-Kommunikation mit [2] einem der Mitautoren des Corman-Drosten-Papiers. Diese Methode zur Modellierung von SARS-CoV-2 wurde im Corman-Drosten-Papier wie folgt beschrieben:
„Einrichtung und Validierung eines diagnostischen Workflows für das 2019-nCoV-Screening und der spezifischen Bestätigung, der in Abwesenheit verfügbarer Virusisolate oder Originalpatientenproben entwickelt wurde. Design und Validierung wurden durch die enge genetische Verwandtschaft mit dem SARS-CoV von 2003 ermöglicht und durch den Einsatz der synthetischen Nukleinsäuretechnologie unterstützt. “
Die Reverse Transcription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist eine wichtige biomolekulare Technologie zum schnellen Nachweis seltener RNA-Fragmente, die im Voraus bekannt sind. Im ersten Schritt werden in der Probe vorhandene RNA-Moleküle revers transkribiert, um cDNA zu ergeben. Die cDNA wird dann in der Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines spezifischen Primerpaars und eines thermostabilen DNA-Polymeraseenzyms amplifiziert. Die Technologie ist hochempfindlich und ihre Nachweisgrenze liegt theoretisch bei 1 Molekül cDNA. Die Spezifität der PCR wird stark von biomolekularen Designfehlern beeinflusst.
Was ist wichtig beim Entwerfen eines RT-PCR-Tests und des in der Corman-Drosten-Veröffentlichung beschriebenen quantitativen RT-qPCR-Tests?
1. Die Primer und Sonden:
a) Die Konzentration der Primer und Sonden muss im optimalen Bereich liegen (100-200 nM)
b) Müssen spezifisch für das Ziel-Gen sein, das sie amplifizieren möchten
c) Müssen einen optimalen Prozentsatz des GC-Gehalts im Verhältnis zu den gesamten stickstoffhaltigen Basen aufweisen (mindestens 40%, höchstens 60%)
d) Für die Virendiagnostik müssen mindestens 3 Primerpaare 3 virale Gene nachweisen (vorzugsweise so weit wie möglich im viralen Genom voneinander entfernt).
2. Die Temperatur, bei der alle Reaktionen stattfinden:
a) DNA-Schmelztemperatur (> 92°)
b) DNA-Amplifikationstemperatur (TaqPol-spezifisch)
c) Tm; die Annealingtemperatur (die Temperatur, bei der die Primer und Sonden die Zielbindung / -ablösung erreichen und 2° C pro Primerpaar nicht überschreiten dürfen). Tm hängt stark vom GC-Gehalt der Primer ab
3. die Anzahl der Amplifikationszyklen (weniger als 35; vorzugsweise 25-30 Zyklen):
Im Falle des Virusnachweises erkennen > 35 Zyklen nur Signale, die nicht mit dem infektiösen Virus korrelieren, wie durch Isolierung in Zellkultur bestimmt [Übersicht in 2]; Wenn jemand durch PCR als positiv getestet wird, wenn ein Schwellenwert von 35 Zyklen oder höher verwendet wird (wie dies in den meisten Labors in Europa und den USA der Fall ist), beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass diese Person tatsächlich infiziert ist, weniger als 3% das Ergebnis ist falsch positiv ist 97% [überprüft in 3]
4. Molekularbiologische Validierungen; amplifizierte PCR-Produkte müssen entweder durch Laufenlassen der Produkte in einem Gel mit einem DNA-Lineal oder durch direkte DNA-Sequenzierung validiert werden
5. Positive und negative Kontrollen sollten spezifiziert werden, um den spezifischen Virusnachweis zu bestätigen / zu widerlegen
6. Es sollte ein Standard Operational Procedure (SOP) verfügbar sein
SOP spezifiziert die obigen Parameter eindeutig, so dass alle Laboratorien in der Lage sind, genau die gleichen Testbedingungen einzurichten. Eine validierte universelle SOP ist unerlässlich, da sie den Vergleich von Daten innerhalb und zwischen Ländern ermöglicht.
KLEINERE BEDENKEN MIT DEM CORMAN-DROSTEN-PAPIER
1. In Tabelle 1 des Corman-Drosten-Papiers sind verschiedene Abkürzungen angegeben – „nM“ ist angegeben, „nm“ nicht. In Bezug auf die korrekte Nomenklatur bedeutet nm „Nanometer“, daher sollte nm hier nM anzeigen.
2. Es ist allgemein anerkannt, genetische Sequenzen immer in 5′-3′-Richtung zu schreiben, einschließlich der Reverse-Primer. Es ist höchst ungewöhnlich, eine Ausrichtung mit dem umgekehrten komplementären Schreiben der Primersequenz durchzuführen, wie dies die Autoren in Abbildung 2 des Corman-Drosten-Papiers getan haben. Hier wird zusätzlich eine Wobbelbasis als „y“ markiert, ohne die Basis zu beschreiben, für die das Y steht.
3. Zwei irreführende Fallstricke im Corman-Drosten-Papier sind, dass ihre Tabelle 1 weder Tm-Werte (Glühtemperaturwerte) enthält noch GC-Werte (Anzahl von G und C in den Sequenzen als % -Wert von Gesamtbasen).
GROSSE BEDENKEN MIT DEM CORMAN-DROSTEN-PAPIER
A) HINTERGRUND
Die Autoren stellen den Hintergrund ihrer wissenschaftlichen Arbeit wie folgt vor: „Der anhaltende Ausbruch des kürzlich aufgetretenen neuartigen Coronavirus (2019-nCoV) stellt eine Herausforderung für Laboratorien im Bereich der öffentlichen Gesundheit dar, da Virusisolate nicht verfügbar sind, während es zunehmend Hinweise darauf gibt, dass der Ausbruch weiter verbreitet ist als Anfangs gedacht, und die internationale Verbreitung durch Reisende findet bereits statt. “
Laut BBC News [4] und Google Statistics [5] gab es am 21. Januar 2020 – dem Tag, an dem das Manuskript eingereicht wurde – weltweit 6 Todesfälle. Warum nahmen die Autoren eine Herausforderung für die Laboratorien für öffentliche Gesundheit an, obwohl es zu diesem Zeitpunkt keine wesentlichen Beweise dafür gab, dass der Ausbruch weiter verbreitet war als ursprünglich angenommen?
Als Ziel erklärten die Autoren, robuste Diagnosemethoden für den Einsatz in Laborumgebungen des öffentlichen Gesundheitswesens zu entwickeln und einzusetzen, ohne dass Virenmaterial zur Verfügung steht. Darüber hinaus erkennen sie an, dass „die vorliegende Studie die enorme Reaktionsfähigkeit zeigt, die durch die Koordination von akademischen und öffentlichen Laboratorien in nationalen und europäischen Forschungsnetzwerken erreicht wird.“
B) METHODEN UND ERGEBNISSE
1. Primer & Probe Design
1a) Fehlerhafte Primerkonzentrationen
Zuverlässige und genaue PCR-Testprotokolle werden normalerweise mit 100 nM bis 200 nM pro Primer entwickelt [7]. In der Corman-Drosten-Arbeit beobachten wir ungewöhnlich hohe und unterschiedliche Primerkonzentrationen für mehrere Primer (Tabelle 1). Für die Primerpaare RdRp_SARSr-F und RdRp_SARSr-R werden 600 nM bzw. 800 nM beschrieben. In ähnlicher Weise empfehlen sie für den Primer-Satz N_Sarbeco_F und N_Sarbeco_R 600 nM bzw. 800 nM [1].
Es sollte klar sein, dass diese Konzentrationen viel zu hoch sind, um für spezifische Amplifikationen von Zielgenen optimal zu sein. Es gibt keinen spezifizierten Grund, diese extrem hohen Primerkonzentrationen in diesem Protokoll zu verwenden. Diese Konzentrationen führen vielmehr zu einer erhöhten unspezifischen Bindung und PCR-Produktamplifikation.
Tabelle 1: Primer und Sonden (entnommer aus dem Corman-Drosten-Papier; fehlerhafte Primerkonzentrationen sind hervorgehoben)
1b) Nicht spezifizierte („Wackelige“) Primer- und Sondensequenzen
Um reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, ist es wichtig, die Primerpaare eindeutig zu definieren. In der Corman-Drosten-Arbeit beobachteten wir sechs nicht spezifizierte Positionen, die durch die Buchstaben R, W, M und S angegeben sind (Tabelle 2). Der Buchstabe W bedeutet, dass an dieser Position entweder ein A oder ein T vorhanden sein kann; R bedeutet, dass es entweder ein G oder ein A geben kann; M zeigt an, dass die Position entweder ein A oder ein C sein kann; Der Buchstabe S zeigt an, dass sich an dieser Position entweder ein G oder ein C befinden kann.
Diese hohe Anzahl von Varianten ist nicht nur ungewöhnlich, sondern auch für Laboratorien äußerst verwirrend. Diese sechs nicht spezifizierten Positionen könnten leicht zum Design mehrerer verschiedener alternativer Primersequenzen führen, die sich nicht auf SARS-CoV-2 beziehen (2 verschiedene RdRp_SARSr_F-Primer + 8 verschiedene RdRp_SARS_P1-Sonden + 4 verschiedene RdRp_SARSr_R). Die Designvariationen führen unweigerlich zu Ergebnissen, die nicht einmal mit SARS CoV-2 zusammenhängen. Daher ist die verwirrende unspezifische Beschreibung im Corman-Drosten-Papier nicht als Standard-Betriebsprotokoll geeignet. Diese nicht spezifizierten Positionen sollten eindeutig entworfen worden sein.
Diese wackeligen Sequenzen haben bereits Anlass zur Sorge auf diesem Gebiet gegeben und bezüglich der offensichtlichen Fehler in den beschriebenen Sequenzen zu einem Brief von Pillonel et al. [8] an den Herausgeber geführt. Diese Fehler sind auch in der Corman et al. Ergänzung ersichtlich.
Tabelle 2: Primer und Sonden (entnommen aus dem Corman-Drosten-Papier; nicht spezifizierte („wackelige“) Nukleotide in den Primern sind hervorgehoben)
Das WHO-Protokoll (Abbildung 1), das direkt aus dem Corman-Drosten-Papier stammt, kommt zu dem Schluss, dass zwei Kontrollgene (das E- und das RdRp-Gen) identifiziert werden müssen, um das Vorhandensein von SARS-CoV-2 im Assay zu bestätigen. Es ist zu beachten, dass das RdPd-Gen eine unsichere Position („wackelig“) im Vorwärtsprimer (R = G/A) und zwei unsichere Positionen im Rückwärtsprimer (R = G/A; S = G/C) aufweist und es hat drei unsichere Positionen in der RdRp-Sonde (W = A/T; R = G/A; M = A/C). Somit können zwei verschiedene Vorwärtsprimer, vier verschiedene Rückwärtsprimer und acht verschiedene Sonden für das RdPd-Gen synthetisiert werden. Zusammen gibt es 64 mögliche Kombinationen von Primern und Sonden!
Das Corman-Drosten-Papier identifiziert ferner ein drittes Gen, das gemäß dem WHO-Protokoll nicht weiter validiert und als unnötig erachtet wurde:
„Bemerkenswerterweise zeigte der N-Gen-Assay ebenfalls eine gute Leistung, wurde jedoch keiner intensiven weiteren Validierung unterzogen, da er etwas weniger empfindlich war.“
Dies war eine unglückliche Auslassung, da es am besten wäre, alle drei Gen-PCRs als Bestätigungstests zu verwenden, und dies hätte zu einem nahezu ausreichenden Diagnose-Tool-Protokoll für den Virus-RNA-Nachweis geführt. Drei bestätigende Testschritte würden zumindest Fehler und Unsicherheiten bei jedem Faltschritt in Bezug auf „wackelige“ Flecken minimieren. (Trotzdem würde das Protokoll unter Berücksichtigung aller anderen Konstruktionsfehler immer noch hinter jeder „guten Laborpraxis“ zurückbleiben.)
Derzeit wird der N-Gen-Assay leider weder in der WHO-Empfehlung (Abbildung 1) als obligatorischer und entscheidender dritter Bestätigungsschritt vorgeschlagen, noch im Corman-Drosten-Papier als wichtige optionale Bestätigung „für einen Routine-Workflow“ hervorgehoben. (Tabelle 2).
Folglich wurden in fast allen Testverfahren weltweit anstelle von allen drei lediglich zwei Primer-Übereinstimmungen verwendet. Dieses Versehen macht das gesamte Testprotokoll unbrauchbar, um bei einer anhaltenden Pandemie genaue Testergebnisse von wirklicher Bedeutung zu liefern.
Abbildung 1: Der N-Gen-Bestätigungstest wird weder als notwendiger dritter Schritt in der offiziellen WHO-Protokollempfehlung für Drosten-Corman [8] hervorgehoben noch als entscheidender Schritt für eine höhere Testgenauigkeit in der Eurosurveillance-Veröffentlichung.
1c) Fehlerhafter GC-Gehalt (diskutiert in 2c zusammen mit der Tempertemperatur (Tm))
1d) Nachweis von viralen Genen
Die RT-PCR wird für die Primärdiagnose einer Infektion nicht empfohlen. Aus diesem Grund ist der in der klinischen Routine zum Nachweis von COVID-19 verwendete RT-PCR-Test für die COVID-19-Diagnose auf regulatorischer Basis nicht indiziert.
„Ärzte müssen die verbesserte Genauigkeit und Geschwindigkeit der molekulardiagnostischen Techniken zur Diagnose von Infektionen erkennen, aber auch ihre Grenzen verstehen. Laborergebnisse sollten immer im Zusammenhang mit der klinischen Präsentation des Patienten interpretiert werden, und für zuverlässige Testergebnisse sind der geeignete Ort, die Qualität und der Zeitpunkt der Probenentnahme erforderlich. “ [9]
Es kann jedoch verwendet werden, um die Differentialdiagnose des Arztes zu erleichtern, wenn er zwischen verschiedenen Infektionen der Lunge unterscheiden muss (Grippe, Covid-19 und SARS haben sehr ähnliche Symptome). Für eine bestätigende Diagnose eines bestimmten Virus müssen mindestens 3 spezifische Primerpaare angewendet werden, um 3 virusspezifische Gene nachzuweisen. Vorzugsweise sollten diese Zielgene mit dem größtmöglichen Abstand im viralen Genom lokalisiert sein (entgegengesetzte Enden eingeschlossen).
Obwohl das Corman-Drosten-Papier 3 Primer beschreibt, decken diese Primer nur ungefähr die Hälfte des Virusgenoms ab. Dies ist ein weiterer Faktor, der die Spezifität für den Nachweis intakter COVID-19-Virus-RNA verringert und den Anteil falsch positiver Testergebnisse erhöht.
Selbst wenn wir drei positive Signale (d.h. die drei Primerpaare ergeben 3 verschiedene Amplifikationsprodukte) in einer Probe erhalten, beweist dies nicht das Vorhandensein eines Virus. Ein besseres Primerdesign hätte terminale Primer an beiden Enden des viralen Genoms. Dies liegt daran, dass das gesamte virale Genom abgedeckt wäre und drei positive Signale besser zwischen einem vollständigen (und damit potenziell infektiösen) Virus und fragmentierten viralen Genomen (ohne infektiöse Potenz) unterscheiden können. Um auf etwas von Bedeutung für die Infektiosität des Virus schließen zu können, sollte das Orf1-Gen, das das essentielle Replikaseenzym von SARS-CoV-Viren codiert, als Ziel aufgenommen werden (Abbildung 2). Die Positionierung der Ziele in der Region des viralen Genoms, die am stärksten und variabel transkribiert wird, ist eine weitere Schwäche des Protokolls.
Kim et al. zeigen eine hochvariable 3′-Expression von subgenomischer RNA in Sars-CoV-2 [23]. Diese RNAs werden aktiv als Signaturen für asymptomatische und nicht infektiöse Patienten überwacht [10]. Es ist höchst fraglich, eine Population von asymptomatischen Personen mit qPCR-Primern zu screenen, die 6 Basenpaare Primer-Dimer am 3-Prim-Ende eines Primers aufweisen (Abbildung 3).
Offenbar empfiehlt die WHO diese Primer. Wir haben alle Wobble-Derivate aus dem Corman-Drosten-Papier mit dem Primer-Dimer-Web-Tool von Thermofisher getestet [11]. Der RdRp-Forward-Primer weist eine 6-bp-3-Prime-Homologie mit Sarbeco E Reverse auf. Bei hohen Primerkonzentrationen reicht dies aus, um Ungenauigkeiten zu erzeugen.
Bemerkenswert: Es gibt eine perfekte Übereinstimmung eines der N-Primer mit einem klinischen Pathogen (Pantoea), das bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem gefunden wurde. Der Reverse Primer entspricht auch Pantoea, jedoch nicht in derselben Region (Abbildung 3).
Dies sind schwerwiegende Designfehler, da der Test nicht zwischen dem gesamten Virus und viralen Fragmenten unterscheiden kann. Der Test kann nicht als Diagnose für SARS-Viren verwendet werden.
Abbildung 2: Relative Positionen von Amplikonzielen auf dem SARS-Coronavirus und dem neuartigen Coronavirus-Genom von 2019. ORF: open reading frame; RdRp: RNA-abhängige RNA-Polymerase. Zahlen unter dem Amplikon sind Genompositionen gemäß SARS-CoV, NC_004718 [1];
Abbildung 3: Ein Test mit dem Thermofischer Primer Dimer Web Tool zeigt, dass der RdRp Forward Primer eine 6bp 3`prime Homologie mit Sarbeco E Reverse aufweist (linkes Feld). Ein weiterer Test zeigt, dass einer der N-Primer perfekt zu einem klinischen Pathogen (Pantoea) passt, das bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem gefunden wurde (rechtes Kästchen).
2. Reaktionstemperaturen
2a) DNA-Schmelztemperatur (> 92 °).
Angemessen im Corman-Drosten-Papier angesprochen.
2b) DNA-Amplifikationstemperatur.
Angemessen im Corman-Drosten-Papier angesprochen.
2c) Fehlerhafte GC-Gehalte und Tm
Die Annealingtemperatur bestimmt, bei welcher Temperatur der Primer an der Zielsequenz anhaftet / sich von dieser löst. Für eine effiziente und spezifische Amplifikation sollte der GC-Gehalt der Primer mindestens 40% und höchstens 60% betragen. Wie in Tabelle 3 angegeben, liegen drei der im Corman-Drosten-Papier beschriebenen Primer nicht im normalen Bereich für den GC-Gehalt. Zwei Primer (RdRp_SARSr_F und RdRp_SARSr_R) haben ungewöhnliche und sehr niedrige GC-Werte von 28% bis 31% für alle möglichen Varianten von Wobble-Basen, während der Primer E_Sarbeco_F einen GC-Wert von 34,6% aufweist (Tabelle 3 und zweites Feld von Tabelle 3). .
Es ist zu beachten, dass der GC-Gehalt die Bindung an sein spezifisches Ziel aufgrund seiner drei Wasserstoffbrückenbindungen bei der Basenpaarung weitgehend bestimmt. Je niedriger der GC-Gehalt des Primers ist, desto geringer ist seine Bindungsfähigkeit an seine spezifische Zielgensequenz (d.h. das nachzuweisende Gen). Dies bedeutet, dass für die Erkennung einer Zielsequenz eine Temperatur gewählt werden muss, die so nahe wie möglich an der tatsächlichen Glühtemperatur (Best-Practice-Wert) liegt, damit sich der Primer nicht wieder löst, und gleichzeitig die Zielsequenz.
Wenn der Tm-Wert sehr niedrig ist, wie dies für alle wackeligen Varianten der RdRp-Reverse-Primer beobachtet wurde, können die Primer unspezifisch an mehrere Ziele binden, wodurch die Spezifität verringert und potenzielle falsch positive Ergebnisse erhöht werden.
Die Glühtemperatur (Tm) ist ein entscheidender Faktor für die Bestimmung der Spezifität / Genauigkeit des qPCR-Verfahrens und wesentlich für die Bewertung der Genauigkeit von qPCR-Protokollen. Best-Practice-Empfehlung: Beide Primer (vorwärts und rückwärts) sollten einen nahezu ähnlichen Wert haben, vorzugsweise den gleichen Wert.
Wir haben die frei verfügbare Primer-Design-Software Primer-BLAST [12, 25] verwendet, um die Best-Practice-Werte für alle im Corman-Drosten-Papier verwendeten Primer auszuwerten (Tabelle 3). Wir haben versucht, einen Tm-Wert von 60 ° C zu finden, während wir in ähnlicher Weise den höchstmöglichen GC % -Wert für alle Primer suchten. Eine maximale Tm-Differenz von 2°C innerhalb der Primerpaare wurde als akzeptabel angesehen. Beim Testen der im Corman-Drosten-Papier angegebenen Primerpaare beobachteten wir einen Unterschied von 10°C in Bezug auf die Tempertemperatur Tm für das Primerpaar 1 (RdRp_SARSr_F und RdRp_SARSr_R). Dies ist ein sehr schwerwiegender Fehler und macht das Protokoll als spezifisches Diagnosewerkzeug unbrauchbar.
Zusätzliche Tests zeigten, dass nur das Primerpaar, das zur Amplifikation des N-Gens (N_Sarbeco_F und N_Sarbeco_R) entwickelt wurde, den geeigneten Standard für einen diagnostischen Test erreichte, da es einen ausreichenden GC-Gehalt und den Tm-Unterschied zwischen den Primern (N_Sarbeco_F und N_Sarbeco_R) aufweist ) beträgt 1,85°C (unterhalb des entscheidenden Maximums von 2°C Differenz). Wichtig ist, dass dies das Gen ist, das weder in den Virusproben getestet (Tabelle 2) noch als Bestätigungstest hervorgehoben wurde. Neben stark variablen Schmelztemperaturen und entarteten Sequenzen in diesen Primern gibt es einen weiteren Faktor, der die Spezifität des Verfahrens beeinflusst: Die dNTPs (0,4 uM) sind 2x höher als für eine hochspezifische Amplifikation empfohlen. Der Reaktion wird zusätzlich Magnesiumsulfat zugesetzt. Dieses Verfahren kann in Kombination mit einer niedrigen Glühtemperatur unspezifische Verstärkungen erzeugen. Wenn für qPCR zusätzliches Magnesium benötigt wird, sollte die Spezifität des Assays weiter untersucht werden.
Die hier beschriebenen Designfehler sind so schwerwiegend, dass es höchst unwahrscheinlich ist, dass eine spezifische Amplifikation des genetischen SARS-CoV-2-Materials unter Verwendung des Protokolls des Corman-Drosten-Papiers auftritt.
Tabelle 3: GC-Gehalt der Primer und Sonden (entnommen aus dem Corman-Drosten-Papier; Aberrationen aufgrund optimierter GC-Gehalte werden hervorgehoben. Das zweite Feld zeigt eine Tabellenauflistung aller Primer-BLAST-Best-Practice-Werte für alle in verwendeten Primer und Sonden das Corman-Drosten-Papier von Prof. Dr. Ulrike Kämmerer & ihrem Team
3. Die Anzahl der Amplifikationszyklen
Es sollte beachtet werden, dass im Corman-Drosten-Papier nirgends erwähnt wird, dass ein Test positiv oder negativ ist oder was tatsächlich ein positives oder negatives Ergebnis definiert. Diese Arten von virologischen Diagnosetests müssen auf einer SOP basieren, einschließlich einer validierten und festen Anzahl von PCR-Zyklen (Ct-Wert), nach denen eine Probe als positiv oder negativ eingestuft wird. Der maximale einigermaßen zuverlässige Ct-Wert beträgt 30 Zyklen. Oberhalb eines Ct von 35 Zyklen muss mit einer schnell zunehmenden Anzahl von falsch positiven Ergebnissen gerechnet werden.
PCR-Daten, die nach einem Ct-Wert von 35 Zyklen als positiv bewertet wurden, sind völlig unzuverlässig.
Unter Berufung auf Jaafar et al. 2020 [3]: „Bei Ct = 35, dem Wert, den wir verwendet haben, um ein positives Ergebnis für die PCR zu melden, sind <3% der Kulturen positiv.“ Mit anderen Worten, es gab keine erfolgreiche Virusisolierung von SARS-CoV-2 bei diesen hohen Ct-Werten.
Darüber hinaus zeigen wissenschaftliche Studien, dass nur nicht infektiöse (tote) Viren mit Ct-Werten von 35 nachgewiesen werden [22].
Zwischen 30 und 35 gibt es eine Grauzone, in der ein positiver Test nicht mit Sicherheit festgestellt werden kann. Dieser Bereich sollte ausgeschlossen werden. Natürlich könnte man 45 PCR-Zyklen durchführen, wie im Corman-Drosten-WHO-Protokoll empfohlen (Abbildung 4), aber dann muss man auch einen angemessenen Ct-Wert definieren (der 30 nicht überschreiten sollte). Ein Analyseergebnis mit einem Ct-Wert von 45 ist jedoch wissenschaftlich und diagnostisch absolut bedeutungslos (ein angemessener Ct-Wert sollte 30 nicht überschreiten). All dies sollte sehr klar kommuniziert werden. Es ist ein schwerwiegender Fehler, dass das Corman-Drosten-Papier nicht den maximalen Ct-Wert erwähnt, bei dem eine Probe eindeutig als positives oder negatives Testergebnis betrachtet werden kann. Dieser wichtige Schwellenwert für den Zyklus ist auch in bisherigen Folgemaßnahmen nicht festgelegt.
Abbildung 4: Empfehlung des RT-PCR-Kits im offiziellen Corman-Drosten-WHO-Protokoll [8]. Es ist nur ein „Cycler“ -Wert (Zyklen) ohne entsprechenden und wissenschaftlich vertretbaren Ct (Cutoff-Wert) zu finden. Dieser oder ein anderer Zykluswert ist im eigentlichen Corman-Drosten-Papier nirgends zu finden.
4. Biomolekulare Validierungen
Um festzustellen, ob es sich bei den amplifizierten Produkten tatsächlich um SARS-CoV-2-Gene handelt, ist die biomolekulare Validierung amplifizierter PCR-Produkte unerlässlich. Für einen Diagnosetest ist diese Validierung ein absolutes Muss.
Die Validierung von PCR-Produkten sollte durchgeführt werden, indem entweder das PCR-Produkt in einem 1%-igen Agarose-EtBr-Gel zusammen mit einem Größenindikator (DNA-Lineal oder DNA-Leiter) laufen gelassen wird, damit die Größe des Produkts geschätzt werden kann. Die Größe muss der berechneten Größe des Amplifikationsprodukts entsprechen. Es ist jedoch noch besser, das Amplifikationsprodukt zu sequenzieren. Letzteres gibt 100%-ige Sicherheit über die Identität des Amplifikationsprodukts. Ohne molekulare Validierung kann man sich über die Identität der amplifizierten PCR-Produkte nicht sicher sein. In Anbetracht der zuvor beschriebenen schwerwiegenden Designfehler können die amplifizierten PCR-Produkte alles sein.
In dem Corman-Drosten-Papier wird auch der Fall kleiner Fragmente von qPCR (etwa 100 bp) nicht erwähnt: Es kann sich entweder um 1,5% Agarosegel oder sogar um ein Acrylamidgel handeln.
Die Tatsache, dass diese PCR-Produkte nicht auf molekularer Ebene validiert wurden, ist ein weiterer auffälliger Fehler des Protokolls, der jeden darauf basierenden Test als spezifisches Diagnosewerkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus unbrauchbar macht.
5. Positive und negative Kontrollen zur Bestätigung / Widerlegung des spezifischen Virusnachweises.
Die im Corman-Drosten-Papier beschriebene unbestätigte Annahme ist, dass SARS-CoV-2 das einzige Virus aus der SARS-ähnlichen Beta-Coronavirus-Gruppe ist, das derzeit beim Menschen Infektionen verursacht. Die Sequenzen, auf denen ihre PCR-Methode basiert, sind in silico-Sequenzen, die von einem Labor in China geliefert wurden [23], da zum Zeitpunkt der Entwicklung des PCR-Tests kein Kontrollmaterial für infektiöses („lebendes“) oder inaktiviertes SARS-CoV- 2 den Autoren zur Verfügung stand. Der PCR-Test wurde daher unter Verwendung der Sequenz des bekannten SARS-CoV als Kontrollmaterial für die Sarbeco-Komponente entworfen (Dr. Meijer, Co-Autor des Corman-Drosten-Papiers in einem E-Mail-Austausch mit Dr. Peter Borger) [2].
Es wird angenommen, dass alle Personen, die mit dem RT-PCR-Test positiv getestet wurden, wie im Corman-Drosten-Papier beschrieben, positiv für SARS-CoV-2-Infektionen sind. Ihre Annahme weist drei schwerwiegende Mängel auf. Erstens kann ein positiver Test für die im Corman-Drosten-Papier beschriebenen RNA-Moleküle nicht mit einer „Infektion mit einem Virus“ gleichgesetzt werden. Ein positiver RT-PCR-Test zeigt lediglich das Vorhandensein viraler RNA-Moleküle an. Wie unter Punkt 1d (oben) gezeigt, wurde der Corman-Drosten-Test nicht zum Nachweis des Virus in voller Länge entwickelt, sondern nur eines Fragmentes des Virus. Wir sind bereits zu dem Schluss gekommen, dass dieser Test als diagnostische Methode zum Nachweis von SARS-Virus-Infektionen als ungeeignet eingestuft werden muss.
Zweitens wurde, und das ist von großer Relevanz, die Funktionalität des veröffentlichten RT-PCR-Tests unter Verwendung einer Positivkontrolle (isolierte SARS-CoV-2-RNA), die ein wesentlicher wissenschaftlicher Goldstandard ist, nicht nachgewiesen.
Drittens heißt es im Corman-Drosten-Papier:
„Um zu zeigen, dass die Assays andere Fledermaus-assoziierte SARS-verwandte Viren nachweisen können, haben wir den E-Gen-Assay verwendet, um sechs von Fledermäusen abgeleitete Stuhlproben von Drexler et al. […] Und Muth et al. […] zu testen. Diese viruspositiven Proben stammten von europäischen Rhinolophidenfledermäusen. Der Nachweis dieser phylogenetischen Ausreißer innerhalb der SARS-verwandten CoV-Klade legt nahe, dass wahrscheinlich alle asiatischen Viren nachgewiesen werden. Dies würde theoretisch eine breite Empfindlichkeit gewährleisten, selbst wenn mehrere unabhängige Virenvarianten aus einem Tierreservoir erworben werden. “
Diese Aussage zeigt, dass das im RT-PCR-Test verwendete E-Gen, wie im Corman-Drosten-Papier beschrieben, nicht spezifisch für SARS-CoV-2 ist.
Die E-Gen-Primer detektieren auch ein breites Spektrum anderer SARS-Viren. Das Genom des Coronavirus ist das größte aller RNA-Viren, die Menschen infizieren, und alle haben eine sehr ähnliche Molekülstruktur. Dennoch weisen SARS-CoV1 und SARS-CoV-2 zwei hochspezifische genetische Fingerabdrücke auf, die sie von den anderen Coronaviren unterscheiden. Erstens ist im N-Protein von SARS-CoV und SARS-CoV-2 eine einzigartige Fingerabdrucksequenz (KTFPPTEPKKDKKKK) vorhanden [13, 14, 15]. Zweitens enthalten sowohl SARS-CoV1 als auch SARS-CoV2 kein HE-Protein, während alle anderen Coronaviren dieses Gen besitzen [13, 14]. Um ein SARS-CoV1- und SARS-CoV-2-PCR-Produkt spezifisch nachzuweisen, sollte die obige Region im N-Gen als Amplifikationsziel ausgewählt worden sein. Ein zuverlässiger diagnostischer Test sollte sich als Bestätigungstest auf diese spezifische Region im N-Gen konzentrieren. Die PCR für dieses N-Gen wurde vom Drosten-Corman-Papier weder weiter validiert noch als Testgen empfohlen, da es mit der SARS-CoV-Originalsonde „nicht so empfindlich“ ist [1].
Darüber hinaus macht das Fehlen des HE-Gens sowohl in SARS-CoV1 als auch in SARS-CoV-2 dieses Gen zur idealen Negativkontrolle, um andere Coronaviren auszuschließen. Das Corman-Drosten-Papier enthält weder diese Negativkontrolle noch andere Negativkontrollen. Der PCR-Test im Corman-Drosten-Papier enthält daher weder eine eindeutige Positivkontrolle noch eine Negativkontrolle, um das Vorhandensein anderer Coronaviren auszuschließen. Dies ist ein weiterer schwerwiegender Konstruktionsfehler, der den Test als für die Diagnose ungeeignet einstuft.
6. Standard Operational Procedure (SOP) ist nicht verfügbar
Es sollte ein Standard Operational Procedure (SOP) verfügbar sein, das die oben genannten Parameter eindeutig spezifiziert, damit alle Laboratorien die gleichen Testbedingungen einrichten können. Eine validierte universelle SOP ist unerlässlich, da sie den Datenvergleich innerhalb und zwischen Ländern erleichtert. Es ist sehr wichtig, alle Primerparameter eindeutig anzugeben. Wir stellen fest, dass dies nicht getan wurde. Ferner ist der Ct-Wert, der angibt, wann eine Probe als positiv oder negativ angesehen werden soll, nicht angegeben. Es wird auch nicht angegeben, wann eine Probe als mit SARS-CoV-Viren infiziert gilt. Wie oben gezeigt, kann der Test nicht zwischen Virus und Virusfragmenten unterscheiden, daher ist der Ct-Wert, der die Positivität anzeigt, von entscheidender Bedeutung. Dieser Ct-Wert sollte im Standard Operational Procedure (SOP) angegeben und online gestellt worden sein, damit alle Laboratorien, die diesen Test durchführen, genau die gleichen Randbedingungen haben. Es weist auf eine fehlerhafte Wissenschaft hin, dass eine solche SOP nicht existiert. Den Laboratorien steht es daher frei, den Test nach eigenem Ermessen durchzuführen, was zu enormen Abweichungen führt.
Laboratorien in ganz Europa haben eine Vielzahl von Fragen:
Welche Primer bestellen?
Welche Nukleotide sollen an den undefinierten Stellen ausgefüllt werden?
Welchen Tm-Wert soll ich wählen?
Wie viele PCR-Zyklen müssen ausgeführt werden?
Bei welchem Ct-Wert ist die Probe positiv?
Und wann ist es negativ?
Und wie viele Gene sollen getestet werden?
Sollten alle Gene getestet werden oder nur das E- und RpRd-Gen, wie in Tabelle 2 des Corman-Drosten-Papiers gezeigt?
Sollte auch das N-Gen getestet werden?
Und was ist ihre negative Kontrolle?
Was ist ihre positive Kontrolle?
Das beschriebene Protokoll ist leider sehr vage und fehlerhaft im Design, so dass man in Dutzende verschiedene Richtungen gehen kann. Es scheint weder eine Standardisierung noch eine SOP zu geben, daher ist nicht klar, wie dieser Test implementiert werden kann.
7. Folgen der unter 1-5 beschriebenen Fehler: Falsch-positive Ergebnisse.
Der im Corman-Drosten-Papier beschriebene RT-PCR-Test enthält so viele molekularbiologische Designfehler (siehe 1-5), dass keine eindeutigen Ergebnisse erzielt werden können. Es ist unvermeidlich, dass dieser Test eine enorme Anzahl von sogenannten „False Positives“ erzeugt. Die Definition von falsch positiven Ergebnissen ist eine negative Stichprobe, die anfänglich positiv bewertet wird, aber nach erneutem Testen mit demselben Test negativ ist. Falsch positive Ergebnisse sind fehlerhafte positive Testergebnisse, d.h. negative Proben, die positiv getestet werden. Und genau solche findet man auch im Corman-Drosten Papier. Auf Seite 6 des Manuskript-PDF zeigen die Autoren, dass mit diesem Test auch unter gut kontrollierten Laborbedingungen ein erheblicher Prozentsatz falsch positiver Ergebnisse erzeugt wird:
„In vier einzelnen Testreaktionen wurde eine schwache Anfangsreaktivität festgestellt, die jedoch beim erneuten Testen mit demselben Assay negativ war. Diese Signale waren mit keinem bestimmten Virus assoziiert, und für jedes Virus, bei dem eine anfängliche positive Reaktivität auftrat, gab es andere Proben, die das gleiche Virus in einer höheren Konzentration enthielten, jedoch nicht positiv testeten. Angesichts der Ergebnisse der oben beschriebenen umfassenden technischen Qualifizierung wurde der Schluss gezogen, dass diese anfängliche Reaktivität nicht auf die chemische Instabilität von Echtzeit-PCR-Sonden, sondern höchstwahrscheinlich auf Probleme bei der Handhabung zurückzuführen ist, die durch die rasche Einführung neuer diagnostischer Tests und Kontrollen während dieser Bewertung verursacht wurden Studie.“ [1]
Der erste Satz dieses Auszugs ist ein klarer Beweis dafür, dass der im Corman-Drosten-Papier beschriebene PCR-Test falsch positive Ergebnisse liefert. Selbst unter den gut kontrollierten Bedingungen des hochmodernen Charité-Labors sind 4 von 310 Primärtests per Definition falsch positiv. Vier negative Proben wurden anfänglich positiv getestet und waren dann beim erneuten Testen negativ. Dies ist das klassische Beispiel für ein „false positive“. In diesem Fall identifizieren die Autoren sie nicht als falsch positiv, was intellektuell unehrlich ist.
Eine weitere verräterische Beobachtung im obigen Auszug ist, dass die Autoren die falsch positiven Ergebnisse als „Umgang mit Problemen, die durch die rasche Einführung neuer diagnostischer Tests verursacht werden“ erklären. Stellen Sie sich die Labore vor, die den Test ohne alle erforderlichen Informationen einführen müssen, die normalerweise in einer SOP beschrieben werden.
8. Das Corman-Drosten-Papier wurde nicht von Experten begutachtet (peer-reviewed)
Vor der offiziellen Veröffentlichung in einer wissenschaftlichen Zeitschrift werden wissenschaftliche und medizinische Artikel traditionell durch „Peer Review“ zertifiziert. In diesem Prozess lassen sich die Redakteure des Journals von verschiedenen Experten („Schiedsrichtern“) beraten, die das Papier bewertet haben und möglicherweise Schwachstellen in seinen Annahmen, Methoden und Schlussfolgerungen feststellen. In der Regel veröffentlicht eine Zeitschrift einen Artikel erst, wenn die Herausgeber davon überzeugt sind, dass die Autoren die Bedenken der Schiedsrichter berücksichtigt haben und die präsentierten Daten die Schlussfolgerungen des Papiers stützen. Dieser Prozess ist auch für die Eurosurveillance beschrieben [16].
Das Papier von Corman-Drosten wurde am 21. Januar 2020 bei Eurosurveillance eingereicht und am 22. Januar 2020 zur Veröffentlichung angenommen. Am 23. Januar 2020 war das Papier online. Am 13. Januar 2020 wurde die Version 1-0 des Protokolls auf der offiziellen Website der WHO [17] veröffentlicht, die am 17. Januar 2020 als Dokumentversion 2-1 [18] aktualisiert wurde, noch bevor das Corman-Drosten-Papier am 23. Januar auf Eurosurveillance veröffentlicht wurde.
Normalerweise ist Peer Review ein zeitaufwändiger Prozess, da mindestens zwei Experten aus dem Bereich das eingereichte Papier kritisch lesen und kommentieren müssen. Unserer Meinung nach wurde dieses Papier nicht von Experten begutachtet. Vierundzwanzig Stunden reichen einfach nicht aus, um eine gründliche Begutachtung durch Fachkollegen durchzuführen. Unsere Schlussfolgerung wird durch die Tatsache gestützt, dass wir eine enorme Anzahl sehr schwerwiegender Konstruktionsfehler festgestellt haben, die den PCR-Test als diagnostisches Instrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus völlig ungeeignet machen. Jeder Molekularbiologe, der mit dem RT-PCR-Design vertraut ist, hätte die schwerwiegenden Fehler, die im Corman-Drosten-Papier vorhanden sind, vor dem eigentlichen Überprüfungsprozess leicht beobachtet. Wir haben Eurosurveillance am 26. Oktober 2020 gebeten, uns eine Kopie des Peer-Review-Berichts zu senden. Bisher haben wir diesen Bericht nicht erhalten, und in einem Schreiben vom 18. November 2020 lehnte das ECDC als Gastgeber der Eurosurveillance den Zugang ab, ohne wesentliche wissenschaftliche Gründe für ihre Entscheidung anzugeben. Im Gegenteil, sie schreiben, dass die „Offenlegung den Zweck wissenschaftlicher Untersuchungen untergraben würde“. [24].
9. Autoren als Herausgeber
Ein letzter Punkt ist von großer Bedeutung. Es stellt sich heraus, dass zwei Autoren des Corman-Drosten-Papiers, Christian Drosten und Chantal Reusken, ebenfalls Mitglieder der Redaktion dieser Zeitschrift (Eurosurveillance) sind [19]. Daher besteht ein schwerwiegender Interessenkonflikt, der den Verdacht verstärkt, dass das Papier nicht von Experten begutachtet wurde. Es scheint, dass die schnelle Veröffentlichung einfach deshalb möglich war, weil die Autoren auch Teil der Redaktion von Eurosurveillance waren. Diese Praxis wird als Beeinträchtigung der wissenschaftlichen Integrität eingestuft.
ZUSAMMENFASSENDER KATALOG DER IM PAPIER GEFUNDENEN FEHLER
Das Corman-Drosten-Papier enthält die folgenden spezifischen Fehler:
1. Es gibt keinen bestimmten Grund, diese extrem hohen Primerkonzentrationen in diesem Protokoll zu verwenden. Die beschriebenen Konzentrationen führen zu erhöhten unspezifischen Bindungen und PCR-Produktamplifikationen, was den Test als spezifisches Diagnosewerkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet macht.
2. Sechs nicht spezifizierte wackelige Positionen führen zu einer enormen Variabilität in den realen Laborimplementierungen dieses Tests. Die verwirrende unspezifische Beschreibung im Corman-Drosten-Papier ist nicht als Standard-Betriebsprotokoll geeignet, sodass der Test als spezifisches Diagnosewerkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet ist.
3. Der Test kann nicht zwischen dem gesamten Virus und viralen Fragmenten unterscheiden. Daher kann der Test nicht als Diagnose für intakte (infektiöse) Viren verwendet werden, sodass der Test als spezifisches Diagnosewerkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus und zur Schlussfolgerung über das Vorhandensein einer Infektion ungeeignet ist.
4. Eine Differenz von 10°C in Bezug auf die Annealingtemperatur Tm für das Primerpaar 1 (RdRp_SARSr_F und RdRp_SARSr_R) macht den Test auch als spezifisches Diagnosewerkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet.
5. Ein schwerwiegender Fehler ist das Weglassen eines Ct-Werts, bei dem eine Probe als positiv und negativ betrachtet wird. Dieser Ct-Wert wird auch nicht in Folgeeinreichungen gefunden, sodass der Test als spezifisches Diagnosewerkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet ist.
6. Die PCR-Produkte wurden auf molekularer Ebene nicht validiert. Diese Tatsache macht das Protokoll als spezifisches Diagnosewerkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus unbrauchbar.
7. Der PCR-Test enthält weder eine eindeutige Positivkontrolle zur Bewertung seiner Spezifität für SARS-CoV-2 noch eine Negativkontrolle zum Ausschluss des Vorhandenseins anderer Coronaviren, so dass der Test als spezifisches Diagnosewerkzeug zur Identifizierung von SARS-CoV-2 ungeeignet ist Virus.
8. Das Testdesign im Corman-Drosten-Papier ist so vage und fehlerhaft, dass man in Dutzende verschiedener Richtungen gehen kann. Nichts ist standardisiert und es gibt keine SOP. Dies stellt die wissenschaftliche Validität des Tests in Frage und macht ihn als spezifisches Diagnosewerkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet.
9. Höchstwahrscheinlich wurde das Corman-Drosten-Papier nicht von Experten begutachtet, so dass der Test als spezifisches Diagnosewerkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet war.
10. Wir stellen schwerwiegende Interessenkonflikte für mindestens vier Autoren fest, zusätzlich zu der Tatsache, dass zwei der Autoren des Corman-Drosten-Papiers (Christian Drosten und Chantal Reusken) Mitglieder der Redaktion von Eurosurveillance sind. Am 29. Juli 2020 wurde ein Interessenkonflikt hinzugefügt (Olfert Landt ist CEO von TIB-Molbiol; Marco Kaiser ist Senior Researcher bei GenExpress und fungiert als wissenschaftlicher Berater für TIB-Molbiol), der in der Originalversion nicht deklariert wurde (und in der PubMed-Version immer noch fehlt); TIB-Molbiol ist das Unternehmen, das als „erstes“ PCR-Kits (Light Mix) auf der Grundlage des im Corman-Drosten-Manuskript veröffentlichten Protokolls herstellte und diese PCR-Test-Kits nach eigenen Angaben vor der Veröffentlichung des Papiers bereits verteilte [20]; Victor Corman & Christian Drosten haben ihre zweite Zugehörigkeit nicht erwähnt: das kommerzielle Testlabor „Labor Berlin“. Beide sind dort für die Virendiagnostik verantwortlich [21] und das Unternehmen ist im Bereich der Echtzeit-PCR-Tests tätig.
In Anbetracht unserer erneuten Prüfung des im Corman-Drosten-Papier beschriebenen Testprotokolls zur Identifizierung von SARS-CoV-2 haben wir Fehler und inhärente Irrtümer festgestellt, die den SARS-CoV-2-PCR-Test unbrauchbar machen.
FAZIT
Die Entscheidung, welche Testprotokolle veröffentlicht und allgemein verfügbar gemacht werden, liegt direkt in den Händen der Eurosurveillance. Die Entscheidung, die im Corman-Drosten-Papier offensichtlichen Fehler anzuerkennen, würden die menschlichen Kosten und das künftige Leid erheblich minimieren.
Ist es nicht im besten Interesse der Eurosurveillance, dieses Papier zurückzuziehen? Unsere Schlussfolgerung ist klar.
Angesichts all der hier beschriebenen enormen Designfehler und -fehler im PCR-Protokoll kommen wir zu dem Schluss: Im Rahmen der wissenschaftlichen Integrität und Verantwortung bleibt eigentlich keine Wahl.
Quellen
[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3):pii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045
[2] Email communication between Dr. Peter Borger & Dr. Adam Meijer: Supplementary Material
[3] Jafaar et al., Correlation Between 3790 Quantitative Polymerase Chain Reaction–Positives Samples and Positive Cell Cultures, Including 1941 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Isolates. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603
[4] BBC, January 21st 2020: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836;
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[5] Google Analytics – COVID19-deaths worldwide:
Archive: https://archive.is/PpqEE
[6] Laboratory testing for COVID-19 Emergency Response Technical Centre, NIVD under
China CDC March 15th, 2020: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf
[7] Real-Time PCR Handbook Life Technologies: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-
handbook.pdf
Nolan T, Huggett J, Sanchez E.Good practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR) First Edition 2013
[8] Trestan Pillonel et al, Letter to the editor: SARS-CoV-2 detection by real-time RT-PCR: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/
[9] Kurkela, Satu, and David WG Brown. “Molecular-diagnostic techniques.” Medicine 38.10
(2009): 535-540.
[10] Wolfel et al., Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x
[11] Thermofischer Primer Dimer Web Tool: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html
Supplementary Material
[12] Primer-BLAST, NCBI – National Center for Biotechnology Information: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW et al. (2003) Science. The
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[14] Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete
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[15] Borger P. A SARS-like Coronavirus was expected but nothing was done to be prepared. Am J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-
like_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared;
Archive: https://archive.is/i76Hu
[16] Eurosurveillance paper evaluation / review process: https://www.eurosurveillance.org/evaluation
[17] Official recommendation of the Corman-Drosten protocol & manuscript by the WHO,published on January 13th 2020 as version 1.0 of the document:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus-assay-
v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf; archive:
[18] Official WHO-recommendation for the Corman / Drosten RT-qPCR-protocol, which
directly derives from the Eurosurveillance-publication, document-version 2-1, published on
17th January 2020: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-
1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2
[19] Eurosurveillance Editorial Board, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-
assets/imgs/2020-09-Editorial%20Board%20PDF.pdf;
Archive:
[20] Instructions For Use LightMix SarbecoV E-gene plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche
Molecular Solutions, January 11th 2020: https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-
gene_V200204_09164154001 (1).pdf
Archive, timestamp – January 11th 2020: https://archive.is/Vulo5;
Archive:
[21] Christian Drosten & Victor Corman, responsible for viral diagnostics at Labor Berlin:
https://www.laborberlin.com/fachbereiche/virologie/
Archive: https://archive.is/CDEUG
[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Viral cultures for COVID-
19 infectivity assessment. Systematic review. Systematic review doi:
https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4
[23] Kim et al.,The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062
[24] ECDC reply to Dr. Peter Borger, 18th November 2020:
Supplementary Material
[25] Prof. Dr. Ulrike Kämmerer & team, survey & Primer-BLAST table:
Supplementary Material
Ergänzende Literatur
Description RT-PCR RKI Germany, on page 10 of this link:
https://www.rki.de/DE/Content/Gesundheitsmonitoring/Gesundheitsberichterstattung/GBE
DownloadsJ/JoHM_S5_2020_Studienprotokoll_CORONA_MONITORING_lokal.pdf?__blob=p
ublicationFile
Autoren
1) Dr. Pieter Borger (MSc, PhD), Molecular Genetics, W+W Research Associate, Lörrach, Germany
2) Rajesh Kumar Malhotra (Artist Alias: Bobby Rajesh Malhotra), Former 3D Artist / Scientific Visualizations at CeMM – Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences (2019-2020), University for Applied Arts – Department for Digital Arts Vienna, Austria
3) Dr. Michael Yeadon BSs(Hons) Biochem Tox U Surrey, PhD Pharmacology U Surrey. Managing Director, Yeadon Consulting Ltd, former Pfizer Chief Scientist, United Kingdom
4) Dr. Clare Craig MA, (Cantab) BM, BCh (Oxon), FRCPath, United Kingdom
5) Kevin McKernan, BS Emory University, Chief Scientific Officer, founder Medical Genomics, engineered the sequencing pipeline at WIBR/MIT for the Human Genome Project, Invented and developed the SOLiD sequencer, awarded patents related to PCR, DNA Isolation and Sequencing, USA
6) Prof. Dr. Klaus Steger, Department of Urology, Pediatric Urology and Andrology, Molecular Andrology, Biomedical Research Center of the Justus Liebig University, Giessen, Germany
7) Dr. Paul McSheehy (BSc, PhD), Biochemist & Industry Pharmacologist, Loerrach, Germany
8) Dr. Lidiya Angelova, MSc in Biology, PhD in Microbiology, Former researcher at the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), Maryland, USA
9) Dr. Fabio Franchi, Former Dirigente Medico (M.D) in an Infectious Disease Ward, specialized in “Infectious Diseases” and “Hygiene and Preventive Medicine”, Società Scientifica per il Principio di Precauzione (SSPP), Italy
10) Dr. med. Thomas Binder, Internist and Cardiologist (FMH), Switzerland
11) Prof. Dr. med. Henrik Ullrich, specialist Diagnostic Radiology, Chief Medical Doctor at the Center for Radiology of Collm Oschatz-Hospital, Germany
12) Prof. Dr. Makoto Ohashi, Professor emeritus, PhD in Microbiology and Immunology, Tokushima University, Japan
13) Dr. Stefano Scoglio, B.Sc. Ph.D., Microbiologist, Nutritionist, Italy
14) Dr. Marjolein Doesburg-van Kleffens (MSc, PhD), specialist in Laboratory Medicine (clinical chemistry), Maasziekenhuis Pantein, Beugen, The Netherlands
15) Dr. Dorothea Gilbert (MSc, PhD), PhD Environmental Chemistry and Toxicology. DGI Consulting Services, Oslo, Norway
16) Dr. Rainer J. Klement, PhD. Department of Radiation Oncology, Leopoldina Hospital Schweinfurt, Germany
17) Dr. Ruth Schruefer, PhD, human genetics/ immunology, Munich, Germany,
18) Dra. Berber W. Pieksma, General Practitioner, The Netherlands
19) Dr. med. Jan Bonte (GJ), Consultant Neurologist, The Netherlands
20) Dr. Bruno H. Dalle Carbonare (Molecular biologist), IP specialist, BDC Basel, Switzerland
21) Dr. Kevin P. Corbett, MSc Nursing (Kings College London) PhD (London South Bank) Social Sciences (Science & Technology Studies) London, England, United Kingdom
22) Prof. Dr. Ulrike Kämmerer, specialist in Virology / Immunology / Human Biology / Cell Biology, University Hospital Würzburg, Germany
